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载体（Vector）的概念/功能/分类-表达载体与克隆载体的区别
1. 载体（Vector）的概念
把一个目的基因通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。基因工程上所用的载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的) DNA而将目的DNA带入宿主细胞。常用的载体有质粒(plasmids)、噬菌体（phage）、病毒（virus）等。
| 载体的功能及特征 | 载体应具备的条件 |
|---|---|
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载体按功能可分成克隆载体和表达载体。
2. 克隆载体(Cloning Vector)
克隆载体大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
| 分类 | 基本性质 | 基本特征（或载体的构建） | 原理机制 | 常用的载体 | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 克隆载体 | 质粒载体 | 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制；不相容性；可转移性（基因工程中采用非接合性质粒） | （1）具有合适的复制起始位点（ORI （2）具有合适的选择性标记基因 （3）若干限制性内切酶的单一位点 （4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。 | 当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。 | pSC101 ColE1 pBR322 pUC18 pUC19 TA载体 | |
| 噬菌体载体 | λ噬菌体 | 其DNA两端的5′末端各带有12个碱基的互补单链，即cos位点。有可替代区，即非必需区。用外源DNA片段替代这个区域，不会影响噬菌体颗粒的形成。 | (1)基因组大小；去除非必需区，建立外源DNA片段的克隆或替换位点（2）在DNA的非必需区插入选择标记：lacZ 基因；基因 cⅠ 失活（cI基因：溶源过程控制基因）；Spi 筛选（野生型 λ 噬菌体在带有 P2 原噬菌体的溶源性 E.coli 中 的生长会受到限制的表型，称作 Spi+ ，即对 P2 噬菌体的干扰敏感） | 1) 通过裂解过程增殖载体2)载体与外源DNA的酶切3) 外源DNA与载体的连接4)重组噬菌体的体外包装5) 包装噬菌体颗粒的感染6)筛选 | 插入式载体 置换型载体 | |
| M13噬菌体载体 | M13 噬菌体的基因组为单链 DNA。噬菌体颗粒的大小受其DNA端点制约的，不存在包装限制。只感染雄性大肠杆菌 | 基因间隔区（intergenic region, IG区） 基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区，内含有复制起始位点，是实施改造、构建人工载体的重点区域。② IG区内只有一个 Bsu I 切点。（2）加入酶切位点，在IG区内加入单一内切酶位点。M13mp1 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（-肽序列)。使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，M13重组分子筛选简便，被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大 但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb | 1、以（+）链DNA为摸板，合成互补（－）链，该双链称复制型DNA（RFDNA）。 2、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。 3、单链特异的DNA结合蛋白结合在（+）链上，从而阻断了其互补链，即（－）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（+）链DNA 游离出来的（+）链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从（+）DNA链上脱落下来，余下的M13（+）链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。 | M13mpn n代表系列数字②对M13mp1的改进加上常用的酶切位点。 M13mp2： LacZ’ 5’端的第13个核苷酸G突变成A，产生了一个EcoR I切点 | ||
| 噬菌体-质粒杂合载体 | 黏粒载体 | 考斯质粒是一类人工构建的含有λ-DNA cos序列和质粒复制子的的特殊类型载体。能像 -DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力：45kb；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力 | 粘粒（cosmid）是带有 cos 序列的质粒。 cos 序列是 噬菌体 DNA 中将 DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。黏粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（ampr）， cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。有的粘粒载体含有两个 cos 位点，在某种程度上可提高使用效率。 | 设计构建的柯斯质粒一般长4～6kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体λ一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。 | ||
| 噬菌粒载体 | 能像质粒那样在受体细胞中自主复制能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞 装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA 重组操作简便，筛选容易 | 噬菌粒载体综合了质粒载体和M13噬菌体载体优点，含有ColEl复制起始位点、抗生素抗性选择标记和丝状体噬菌体DNA间隔区(含有噬菌体DNA复制起始、终止以及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用元件) 它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体 | 1.具有较小分子量基因组DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作； 2.编码一个ampr基因作为选择记号，便于转化子的选择； 3.拷贝数含量高 4.存在着一个多克隆位点区，因此多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上； 5.多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5’-端编码区，可按照IPTG显色反应试验筛选 6.lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达； 7.含有质粒的复制起点，可复制形成大量的双链DNA分子 8.带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中； 在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA | pUC118和pUC119 | ||
3. 表达载体（Expression Vectors）
表达载体是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点，其后的多克隆位点可装载目标基因。
| 分类 | 结构组成及表达元件 | 特点或优点 | 备注 | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 质粒表达载体 | 原核表达载体 | 启动子转录终止子（防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性）核糖体结合位点 | 表达方式有： 组成型表达 诱导型表达 融合型表达 分泌型表达 | 启动子类型：根据作用方式及功能分类 ①组成型启动子 ②组织特异启动子 ③诱导型启动子 | |
| 酵母表达载体 | 来自pBR322基本骨架 含有该质粒复制起始位点(ori)，lacZ基因、bla或ampr、tetr等基因。含有URA3、HIS3、LEU2、TRPl、LYS2与特定的宿主营养缺陷突变体互补筛选或利用zeocin、basticidin（杀稻瘟菌素）的抗性基因筛选。启动子有GAP、AOXl、AUGl和GAL1等。 | GAP是组成型启动子。其余是诱导型启动子。酵母表达载体多为穿梭载体：既可以在大肠杆菌中繁殖，获得足够的载体DNA进行体外操作，又可以在酵母中复制、表达和选择。融合蛋白表达载体：于外源基因插入位点的C端或N端插入了1个6×His标签，或在5’端插入了α-因子作为分泌信号 | 由于原核生物和真核生物存在糖基化、酰基化等翻译后修饰反应机制的差异，真核基因的原核表达难以获得有活性的蛋白。酵母成为真核表达的首选系统。 | ||
| Ti质粒表达载体 | 一元载体 | 一元载体就是含目的基因的中间表达载体与改造后的受体(Ti质粒)通过同源重组所产生的一种复合型载体，也称为共整合载体。由于该载体的T-DNA区与Vir区紧密连锁，也称为顺式载体(cis-vector) | Ti质粒是根癌农杆菌中发现的可引发植物产生冠瘿瘤的质粒。根据冠瘿瘤合成的冠瘿碱种类，Ti质粒可分为章鱼碱、农杆碱、农杆菌素和琥珀碱4种不同类型Ti质粒可分为T-DNA、Vir、Con和Ori 4个功能区。 T-DNA区：是Ti质粒中能转移到植物细胞内的区域。 Vir区：位于T-DNA区的上游，其表达产物可激活T-DNA向植物细胞的转移，这一个区域也称为致病区。 Con区：该区含有与农杆菌之间接合转移有关的基因(tra)，这些基因受宿主细胞合成的冠瘿碱激活，使Ti质粒在细菌之间转移。 Ori区：调控Ti质粒的自我复制，为复制起始区 | 构建的基本原理： 引入分子质量较小的中间载体，将欲转化的目的基因及抗性标记基因构建到中间载体上。 将Ti质粒上T-DNA的致瘤基因全部去掉，仅保留其两边界及与T-DNA转移所必需的25个碱基序列，构建成所谓卸甲载体。在卸甲载体的T-DNA区被删除致瘤基因位点插入中间载体同源的质粒序列，将中间载体转入含有卸甲载体的根癌农杆菌中，构建在中间载体上目的基因可通过同源重组整合到卸甲载体Ti质粒的T-DNA区，并与卸甲载体Ti质粒一起复制。 | |
| 二元载体 | 双元表达载体系统主要包括两个部分： 一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。另一部份是微型Ti质粒，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及Lac Z基因等。 | 双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。 与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制 双元表达载体构件方便，转化效率高于一元载体。 | |||
| 病毒表达载体 | 杆状病毒表达载体 | 杆状病毒表达系统的基本元件： (1)启动子：多个启动子同时表达多个外源基因。(2)poly A加尾信号： (3)同源重组序列。 (4)穿梭载体必需元件。除带有病毒自身的复制起始位点外，还带有pUC质粒的复制子及以ampr，可以在细菌内进行扩增。(5)筛选标记。 | ①重组蛋白具有完整的生物学功能：接近天然蛋白。②能进行翻译后的加工修饰：研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方面的理想模型。③表达水平高：最高可使目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50％。④能容纳大分子的插入片段：上限未知。⑤能同时表达多个基因：在同一细胞内同时表达多个基因。⑥能表达基因组DNA：昆虫杆状病毒表达系统具有剪切的功能。⑦对重组蛋白进行定位的功能：如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等。 | 杆状病毒科病毒，杆状病毒颗粒，双链闭合环状DNA病毒，专一性感染无脊椎动物 将外源基因先克隆到转移载体上，再与病毒基因组共同转染细胞，通过细胞内的同源重组获得带有外源基因的重组病毒的策略。 | |
| 腺病毒载体 | 腺病毒DNA末端结构突出特点 1）带有100bp反向的末端重复序列(ITR)，而且在每一条单链的5’-末端还共价地连接着末端结合蛋白，对病毒的复制有重要作用。 当它从病毒颗粒中分离出来之时，便会自发地环化起来，尔后许多环形分子又聚合成多聚体 | 腺病毒载体是目前最为广泛应用的基因载体，也是唯一基因药物的载体双链DNA的分子大小约为36kb. 可应用于1.基因治疗2.表达真核基因3.研制疫苗 | 首先构建一个含多克隆位点和筛选标志的转移质粒，该质粒含有病毒基因组某段早期序列；然后将一个含有启动子一外源基因-poly A的表达盒插入到上述质粒中腺病毒E1、E3或E4至右侧的ITR区之间，构建成载有外源基因的穿梭质粒。 | ||
| 反转录病毒载体 | 泡沫病毒类 | 从5’端开始依次是：①5’长末端重复序列(5’-LTR)，带有增强子和启动子序列；②psi序列，又称ψ序列，是病毒包装所必须的信号序列；③gag，编码病毒衣壳蛋白；④pol，编码反转录酶和整合酶(Int)；⑤env，编码病毒颗粒外层包装蛋白；⑥3’长末端重复序列(3’-LTR)，带有poly A加尾信号序列。 | 一类含单链RNA的动物病毒。它的基因组含有2条相同的正链RNA分子，包装成二倍体病毒颗粒。（1）在大多数情况下，反转录病毒的肿瘤基因(onc)都能够在正常的细胞中转录。 2）反转录病毒的寄主范围相当广，包括无脊椎动物和脊椎动物。3）反转录病毒具有强启动子，外源基因可得到有效表达。4）反转录病毒不但感染效率高，而且不招致寄主细胞的死亡 | 载体的构建: 分离原病毒DNA→删去部分序列→组入选择性标记基因、目的基因和调控元件→克隆到含有大肠杆菌复制起始位点的克隆载体→转化大肠杆菌→获得反转录病毒克隆载体→ 辅助细胞系(包装细胞系) →扩增 | |
| 慢病毒类致癌病毒类 | |||||
| SV40病毒型转化载体 | 根据SV40 DNA进入敏感动物细胞的转录方向，分为早期转录区和晚期转录区。 早期转录区包括与病毒感染相关的t抗原基因(small T-antigen)和T抗原基因(large T-antigen)等；含有BamHI等限制性内切核酸酶识别位点；晚期转录区包括与病毒壳蛋白合成相关的基因，含有EcoRi等限制性内切核 酸酶识别位点。 | ①含有能够被真核细胞识别的有效的启动子。②有许多种动物病毒，在其感染周期中都能够持续地复制，使其基因组拷贝数达到相当高的水平。③有些动物病毒具有控制自己复制的顺式元件和反式作用因子。④有些动物病毒，在它们的复制过程中能高效稳定地整合到寄主核基因组上。⑤病毒的外壳蛋白质能够识别细胞接受器。用病毒外壳蛋白质包装重组质粒DNA形成的假病毒颗粒，即构成了一种高效的转化体系 | 猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40, SV40)基因组是一种环形双链的DNA，其大小仅有5243bp，很适于基因操作。导致人体癌变的可能性极低，对人体是安全的。一些质粒型表达载体带有来自SV40DNA的个别调控区，位于病毒的早期与晚期转录单位之间，包括1、DNA复制起始位点2、早期与晚期mRNA转录的起始位点3、能激活复制起始位点并可自动调节早期转录的T抗原结合位点4、可被细胞转录因子识别的一般由3个G/C丰富的21bp同向复制区组成的序列5、组成SV40早期增强子的2段72bp同向重复序列。 | ||
| 大片段表达载体 | TAC-可转移人工载体 | 结合了PAC和双元载体的优点：1、具有多克隆位点，2、具有P1复制子和RI质粒复制子能在大肠杆菌和农杆菌中以单拷贝的形式穿梭复制。3、其T-DNA 右边界处插入了植物选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt ）和Pnos 启动子。4、在TAC 载体中重组筛选标记是卡那霉素抗性基因和sacB 基因 | 应用TAC载体在获得目的克隆后可不必进行烦琐的亚克隆，而可直接进行植物转化并开展功能互补分析，可大大促进功能基因的精细定位和图位克隆。 | TAC 载体具有克隆大片段DNA 和借助于农杆菌直接转化植物的功能。TAC还具有以下优越性：①可通过农杆菌介导直接进行基因功能互补实验。TAC 载体中具有P1 裂解子，可以在IPTG 的诱导下产生5-20个拷贝，提高了质粒产量。 | |
| MAC-哺乳动物人工染色体 | 外源DNA片段的容量大；不整合到宿主染色体上，不会破坏宿主基因组的结合和功能，可以稳定地存在；较少发生基因沉默现象 | MAC构建的理论基础在于将哺乳动物染色体复制起始位点序列、端粒和着丝点分离出来，然后和一些载体元件组合构成人工染色体，可以将外源基因及其调控序列引入哺乳动物。它与宿主细胞内的染色体一样稳定，但并不整合人宿主基因组。 | |||
