重组表达载体的构建方法及步骤

构建质粒载体所用的方法基本上是分子克隆技术，是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。

一. 载体的选择及如何阅读质粒图谱

目前，载体主要有病毒和非病毒两大类，其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。

一个质粒的组成要素：

1) 复制起始位点Ori即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。

2) 抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+1，Kan+

3) 多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段

4) P/E启动子/增强子

5) Terms终止信号

6) 加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用

选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：

1. 构建DNA重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

2. 载体的类型：

1) 克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。

2) 表达载体根据受体细胞类型分类－原核/真核/穿梭，E. coli/哺乳类细胞表达载体。

3) 对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

3. 载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：

1. 选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多；

2. 一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒 <10个。

3. 必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；

4. 必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。

5. 满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。

无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。

如何阅读质粒图谱

第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）

第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。

1) Ampr水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。

2) tetr可以阻止四环素进入细胞。

3) camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。

4) neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使 G418（长那霉素衍生物）失活

5) hygr使潮霉素-β失活。

第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些酶切位点以外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb 的外源 DNA 片段。一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。

第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。

第六步：启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号

1) 启动子－促进DNA转录的DNA序列，这个DNA区域常在基因或操纵子编码序列的上游，是DNA分子上可以与RNA-pol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。

2) 增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。

3) 核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。

4) 转录终止序列（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。

质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上。根据表达宿主不同，构建时所选择的载体也会不同。

二. 目的基因的获取

目的DNA的获取需根据其目的基因序列和启动子序列设计引物，为提高目的基因产率，采用两次PCR的方法，即第一次设计引物扩增全序列基因，第二次设计带酶切位点的引物以第一次扩增产物为模板进行扩增，进而加尾连接到T-DNA上，再利用电转化的方法将连接产物转化到带有PCAMBIA1381的DH5α感受态细胞中复制表达。

引物设计

第一次引物设计：

  正向引物： sinn3F    冰盒标注：P2a

      引物序列：5’— AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA—3’

      引物长度：25bp

  反向引物：sinn3R    冰盒标注：P2b

      引物序列：5’— GCAAGAGCGTCGTTTGTAGTTA—3’

      引物长度：22bp

第二次引物设计（带酶切位点）：

  正向引物： sinn3FE   冰盒标注：P2c

      引物序列：5’— ACTGGATCC AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA—3’

      引物长度：34bp

  反向引物：sinn3RE   冰盒标注：P2d

      引物序列：5’— TCACTGCAGCTCATAAGACCAAAGAACGTTTCTT—3’

      引物长度：34bp

PCR扩增

PCR即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶的催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、延伸、复性等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。

  PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2。

PCR反应的基本步骤：

l 变性：高温使双链DNA解离成单链。（94℃  30s）

l 退火：低温下引物与模板DNA互补区结合形成杂交分子。（55℃  30s）  

l 延伸：中温延伸。 在DNA聚合酶、dNTP、Mg2+存在下， DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链5’向3’方向的延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。 （70-72℃  30-60s）

以上三个步骤为一循环，每一循环的产物均可作为下一循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n形式增加。

PCR检测：PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色琼脂糖凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。

PCR反应体系

第一次PCR扩增：

调整PCR反应体系中各成份、组成及反应条件，经多次反复试验结果得出下面的体系可得到清晰明亮的目的DNA电泳条带（1kb）：

  PCR反应体系2*100ul（每管25ul，共8管）

PCR反应条件：

将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的DNA条带，共切3管，分别标注A、B、C。首先用25ul约60℃的无菌蒸馏水洗脱A管一次，洗脱液标注1，分别用15ul的无菌蒸馏水洗脱B管和C管，得到的DNA洗脱液标注2，最后各用30ul的无菌蒸馏水洗脱A、B、C管，得到的DNA洗脱液分别标注a、b、c。

第二次PCR扩增（带酶切位点）：

分别用DNA的洗脱液2、a、b、c为模板，进行第二次PCR扩增，设计反应体系（各25ul）如下：

PCR反应条件：

电泳结果表明：以2管和c管为模板可得到明显的目的基因条带，依据此次电泳结果，可先后再利用PCR扩增（各100ul，每管25ul，共8管）

PCR反应体系2*100ul（每管25ul，共8管）

PCR反应条件：

电泳条带明显而且明亮，切胶回收保存待用。

电泳实验流程

1. 配胶

1) 配制适量的电泳及制胶用的缓冲液（1X TAE Buffer）

2) 根据制胶量和凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉（1g），加入适当的锥形瓶中。

3) 加入一定量的电泳缓冲液（1X TAE Buffer 100ml）。

4) 熔化完全，冷却至600C左右，加入EB5-7ul，充分混匀。

5) 将溶液倒入制胶模中，之前应在适当位置插上梳子。

6) 室温下凝固，不立即使用时，可用保鲜膜将凝胶包好后放40C保存，一般可保存2-5天。

2. 电泳

取适量的PCR产物与适量的溴酚蓝混合混匀后加入凝胶槽中，另取适量的DNA Maker 加入右边槽中，开始电泳。

3. 紫外观察电泳条带

当溴酚蓝跑到适当位置时，在紫外光下观察目的基因的电泳条带（1kb处）

4. 切胶回收目的DNA

目的DNA加尾

用25ul的无菌蒸馏水洗脱DNA，再用20ul的无菌蒸馏水洗脱，共得约40ul的洗脱液，然后抽真空使其浓缩至约8ul。

加尾10ul体系：

PCR条件：72℃ 30-40min  降至4℃即可              

连接T-DNA

连接10ul体系：

连接条件： 4000rpm甩30sec   4℃过夜

三. 感受态DH5α的制备

转化是将外源DNA分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状。受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株，不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体，可以容忍外源的DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代，受体细胞经过一些特殊的方法，如电击、CaCl2等化学试剂处理后，细胞膜的通透性增加，成为感受态细胞，使外源的DNA分子可以进入。

CaCl2法制备感受态大肠杆菌的方法步骤：

1. 配制0.05mol/l的CaCl2-15％的甘油混合溶液，高温高压灭菌。注：CaCl2必须为分析纯以上，

2. 实验中所需要的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净，高温高压灭菌。注：最好有用于制备感受态细胞的一套专用器材。

3. 受体菌的培养：从非选择性LB培养基上挑取E. coli单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长期中后期。将该菌悬液以1：100的比例接种于50-100ml LB培养基中，37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5。注：培养时间不宜超过2.5小时，否则不能达到最高转化效率。

实验步骤：

1) 细菌的收获：培养液冰浴5分钟后，4℃ 5000rpm离心5分钟。

2) 用欲冷的去离子水洗涤沉淀，4℃ 5000rpm离心5分钟。

3) 沉淀加入2ml欲冷的0.05mol/l的CaCl2-15％的甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分钟，0.05mol/l的CaCl2-15％的甘油混合溶液

4) 沉淀加入2ml欲冷的0.05mol/l的CaCl2-15％的甘油混合溶液，轻吹散，即成为感受态细胞悬液。分装成50-100ul的小份，置于-70℃可保存半年。

注：最好在两个月内用完，然后重新制备。若要进一步提高转化效率，可将加入的溶液体积减少到1ml或分装成200ul/管。

电转化法制备感受态大肠杆菌的方法步骤：

1) 前夜接种受体菌（DH5α），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜。

2) 取2ml过夜培养物接种于200ml LB培养基中，37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.5（约2.5-3小时）。

3) 将菌液迅速置于冰上，以下步骤务必在超净工作台和冰上操作。

4) 吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟。

5) 4℃ 3000rpm冷冻离心5分钟

6) 弃去上清，加入1500ul冰冷的10％甘油，用移液枪上下吸动打匀，使细胞重新悬浮。

7) 4℃ 3000rpm冷冻离心5分钟

8) 弃去上清，加入750ul冰冷的10％甘油，用移液枪上下吸动打匀，使细胞重新悬浮。

9) 4℃3000rpm冷冻离心5分钟

10) 加入20ul冰冷的10％甘油，用移液枪上下吸动打匀，使细胞重新悬浮。

11) 立即使用或迅速置于-70℃超低温保存。

四. 转化

基本原理

感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。PUC18的LacZ基因区域当有DNA片段插入时，LacZ基因失活，转化进入大肠杆菌并在含有IPTG和X-gal生长时会产生白色的克隆，不含插入片段的PUC18质粒进入宿主细胞，生成蓝色菌落。

方法步骤

1) 在已制好的LB液体培养基（各250ml）中分别加入氨苄青霉素250ul和卡那霉素500ml，摇匀后倒无菌平板，各倒7个，待凝固。

2) 用无水乙醇清洗浸泡在75％乙醇中的电击杯，于超净工作台桑吹干或烘箱中烘干。将连接产物和0。1CM的电击被杯一起置于冰上预冷。准备3管800ul的无抗LB，于冰上预冷。

3) 从-70℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻。

4) 取3ul连接产物加入到50-100ul感受态细胞中，混匀后转入电击杯中，轻轻敲击电击杯使混合物均匀进入电击杯的底部。

5) 打开电转仪，将电击杯放入。

6) 按一下Pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入800ul的LB培养基，重新悬浮细胞后，转移到1。5ml的离心管中。

7) 37℃，100rpm复苏1-1。5h

8) 5000rpm离心5分钟，弃上清剩100ul，取10-50ul（40ul）涂板，放于37℃过夜培养。次日查看转化结果。